药品研发方法验证异常情况分析:定量限测不准

  新闻资讯     |      2019-05-24 02:46:17
定量限的概念解析
 
 
 
中国药典2015年版四部通则9101对定量限概念的定义为:“定量限系指试样中被测物能被定量测定的最低量,其测定结果应符合准确度和精密度要求。对微量或痕量药物分析、定量测定药物杂质和降解产物时,应确定方法的定量限……一般以信噪比为10:1时相应浓度或注入仪器的量确定定量限。”这一概念为目前定量限的主流定义,ICH与欧美日等各国相关指导原则对定量限定义都与此大致相同。
 
 
 
定量限验证概述
 
 
 
上述概念对方法验证中定量限验证的做法有着重要的影响,定量限验证的做法在近些年也发生了许多的变化,如早期主要的工作在于确认信噪比10的各组分浓度,演变为定量限也需要考察响应情况的精密度,直至目前主流的定量限还需要考察回收率的结果。
 
随着定量限验证内容的增加,定量限验证过程中出现的问题也越来越多,具体验证的做法也逐渐发生了变化,下面的章节讨论验证过程中出现的各种问题与由此引起的定量限验证具体做法的变化。
 
 
 
定量限验证异常情况1:连续进样,出现信噪比小于10的数据
 
 
 
如上文所述在早期(如十年前)的方法验证中,定量限验证仅要求确认信噪比为10的各组分浓度,后来逐渐增加了考察信噪比为10的各组分定量限浓度下的响应情况的精密度研究。由此必然会引入一个风险,即样品浓度一致信号响应大致相同,但是不能确保每次进样的噪音都完全一致,遂出现信噪比在10附件波动的情况,可能某一次或数次信噪比小于10,不符合相关指导原则对定量限的定义“一般以信噪比为10:1时相应浓度或注入仪器的量确定定量限”。
 
由于上述情况的出现,引起了许多人对定量限概念的思考,该阶段的思考主要在以下几个问题:
 
 
 
1、信噪比能说明什么?--定量限测不准原理
 
信噪比,顾名思义,就是组分响应信号与基线噪音的比值。我们都知道,液相色谱的响应值并不是一个固定值,会随着仪器状态(如氘灯能量)、不同品牌型号等差异导致响应信号不同;基线噪音也是如此,不同流动相、不同日期、不同仪器、不同类型检测器、同一台仪器不同状态等都会导致噪音的值存在明显的差异。通过以上分析可知,信噪比是一个随机的不确定的值,那么这个值到底能说明什么问题?
 
上面的问题很难回答,但是有一点能确定,即方法验证过程中找出来的信噪比10的浓度的溶液,换一台仪器或者换流动相等参数,信噪比就极大可能不是10了,这是个几乎不能重现的结果。换个角度分析,也可以说信噪比10的溶液浓度是不确定的。由此我们可以得出一个原理,即定量限测不准原理,该原理可以表述为以下的形式:以信噪比10为某个组分的定量限,则其浓度是不确定的;以某个确定的浓度为定量限,则其信噪比不一定总是10;即信噪比10与浓度二者必有一个是不确定的。
 
 
 
2、定量限的信噪比必须是10吗?
 
由于定量限测不准原理,越来越多的人在质疑定量限信噪比10的规定的合理性,于是许多人逐渐摒弃了定量限信噪比10的规定,但是这些人中分出两个主要的群体:一部分人有限摒弃该规定,具体做法是配制某个浓度(一般为限度的1/n,n≥2),在这个浓度下信噪比大于10,但是也不能偏离太多,一般不大于100;另一部分人为彻底摒弃,具体做法是配制某个浓度(一般为限度的1/n,n≥2),在这个浓度下信噪比大于10即可,以确认方法有足够的灵敏度。
 
到目前为止,仍然有许多同仁陷在定量限信噪比10的坑里没爬出来,我想对这些同仁说:“我们的躯体可以被束缚,但是思想不能被禁锢。”
 
 
 
3、 定量限为试样中被测物能被定量测定的最低量,找出这个值有意义吗?
 
提供杂质检测的结果时,结果的接收方一般不关注方法能检出的最低量,大多数只关注实测值或者是否超过限度,因此在实际检测过程中,报告的杂质检测结果小于一定的值之后就很可能没有了意义,如原料药有关物质检测结果,某杂质限度为0.1%,报告的实际检测结果为“0.0003%”与“小于0.02%”并没有实际上的差别,都足以让结果的接受方得出供试品中该杂质含量远低于限度要求的判断。因此ICH的相关指导原则中提出了报告限的概念,含量低于报告限的杂质在检测结果中可以不必报告具体检测值,如果遵循ICH相关指导原则的规定,确认分析方法在报告限浓度水平具有良好的灵敏度、精密度与准确度就足以满足实际检测需要。
 
由于定量限测不准原理的存在,被测物能被定量测定的最低量在实际检测工作中是不稳定的随机的值,因此方法验证中确定该值并无太大的实质上的意义。
 
一般来说,没有必要确定定量限,但是在某些情况下如药代动力学研究过程中,待测样品的含量可能是一个非常大的区间,对仪器与分析方法的定量限研究对于相关研究具有一定的指导意义,因此具有一定的积极意义,但仍然要充分评估各种条件变动对该值变化存在的风险。
 
 
 
定量限验证异常情况2:回收率不符合规定
 
 
 
最近逐渐兴起定量限需要做准确度验证的做法,中国药典2015年版四部通则9101对定量限概念的定义中明确提出定量限“其测定结果应符合准确度和精密度要求”,于是越来越多的人开始进行定量限浓度的回收率试验。
 
定量限浓度的回收率试验一般浓度小响应误差大,回收率经常不符合规定,这属于正常情况,可以理解;但是正常归正常理解归理解,可不符合规定就不符合指导原则要求的“测定结果应符合准确度要求”的定义,应该怎么处理呢?
 
 
 
1、放宽定量限回收率的可接受标准
 
以有关物质方法验证为例,如果其他三个浓度水平的回收率可接受标准为80%~120%,则将定量限回收率可接受标准放宽至70%~130%;这是目前较为常见的一类做法,是上文中提到的未彻底摒弃信噪比10规定的同仁较常见的做法,似乎非常合理,定量限响应低误差大,所以回收率相对放宽,很合理。但是…..事情总是有但是,从检测结果的准确度角度来看,是否可以认为定量限浓度水平的检测结果较其他浓度水平的检测结果更加不准确?对于检测结果准确度的要求可以这样随意更改吗?那以后定量限水平的检测结果是可信还是不可信?
 
如果深究的话,似乎放宽定量限回收率的做法也有一定的问题,而且这种放宽是非常随意没有什么依据的做法,由于该做法存在以上的矛盾,所以又有了另一种做法,如下:
 
 
 
2、提高定量限浓度
 
既然是由于浓度小响应误差大导致回收率不符合规定,那么提高定量限浓度也就增加了响应减小了检测误差,则可避免由此导致的回收率不符合规定的情况。这种做法常见于上文提到的彻底摒弃信噪比10规定的同仁,定量限水平的回收率可接受标准同其他浓度水平,即其检测结果的准确度同其他浓度水平。
 
该种做法的出现,可以说标志着定量限的概念已经千疮百孔、名存实亡。为什么这么说?因为在该浓度下的信噪比可能已经达到了好几百,远大于指导原则中对于信噪比10的要求,这个浓度与定量限还有多大的关系?只是以定量限的名义对方法的灵敏度是否符合检测要求的一次确认而已。于是笔者有了一个大胆的想法:
 
 
 
定量限验证的概念应被放弃,代之以基于风险的理解对方法的灵敏度进行判断
 
 
 
这种耸人听闻的观念应该会产生很大的冲击,一定会有许多同仁不能接受,毕竟存在了这么多年深入人心的定量限概念,笔者竟敢信口开河说要彻底放弃,俗语说癞蛤蟆打哈欠—恁大的口气!如果上文的内容还不足以说明定量限概念的不合时宜,笔者下文将会给出对定量限的致命一击。
 
定量限概念的不严谨与局限性,给实践带来了各种各样的困扰,上述验证的各种问题只是其中一个方面,另一个方面体现在日常检测工作中。定量限概念中要求“其测定结果应符合准确度和精密度要求”,这句话的本意是低于定量限的结果准确度与精密度皆不可知,从严谨的态度出发,日常检测过程中,低于定量限的检测结果不应被出示,也就是说如果某组分的实测结果小于定量限,在COA中不得出现数值的表现形式,而应表达为“小于定量限”。该要求有其先进性,但是它的局限性在于定量限测不准,也就是说日常检测过程中不能知道定量限的具体值。或许有同仁会反驳说,QC实验室在做方法转移或者方法确认时会验证定量限,同上文所述,方法转移或者方法确认的定量限数据能适用所有的状态吗?
 
结合以上两种情况,我们已经知道定量限的概念对验证与日常检测都带来了无法逾越的障碍,所以它必须被彻底放弃,我们不提定量限不管信噪比10,我们只研究方法能达到的风险较低的具有准确度与精密度的最低允许的检测结果,即方法的灵敏度应当符合要求。以有关物质为例,如果某个组分的限度为0.1%,如果0.02%水平下在响应最差的仪器中信噪比仍然达到100,且回收率验证与精密度验证均符合规定,则可以认为该数字可以适用于今后的日常检测,即如果有小于0.02%的检测结果,在COA中表述为“小于0.02%”,如果方法中规定了报告限或遵循ICH相关指导原则中报告限的规定,且0.02%小于报告限,也可表述为“小于报告限”。
 
如果方法的灵敏度存在风险,应当在系统适用性试验中增加灵敏度的相关试验。以有关物质为例,如某组分的限度0.1%,方法验证时0.05%水平下信噪比20,回收率验证与精密度验证均符合规定,该水平为日常检测报告的最低值,则在系统适用性试验中应确认该组分0.05%水平下信噪比不小于20。
 
 
 
其他
 
 
 
方法的全生命周期的过程需要伴随知识管理的过程,如上文所述在方法验证期间确认的日常检测最低报告值需要由方法验证的负责人传递至QC相关人员。
 
限于经验及知识的限制,笔者所述未必正确,如睿智的读者有其他观点,欢迎指点迷津。
 
如果各位读者在方法验证中有其他的异常情况,也欢迎分享,笔者会收集相关内容并进行原因分析。拜谢!
【来源:anytesting】
 
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